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点击次数:2209 发布时间:2017-11-17

WB试验之如何选择内参抗体

检测某一个基因的表达产物或者要比较表达产物量的相对变化,方法是western blot。而Western Blot试验中比较这些的前提条件是等量的细胞上样,这样才有比较的基础。而人为的操作会产生一定的误差,这些误差可以通过测定每个样品中实际转到膜上的内参来校正。因此选择一个合适的内参抗体来校正上样误差是非常重要的。所以严谨的Western Blot实验设计中需要有良好的参照体系,后续的实验结果分析才具有说服性。

在Western Bloting实验中,可能内参即是内部参照(Internal Control),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

在Western Blotting 中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差,这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

常用的细胞总蛋白质内参有GAPDH、beta-actin和beta-tubulin等。对于一些植物的样本,则需要特别的植物Actin蛋白作为内参,同样的,如果提取的样本是细胞核蛋白,那么PCNA或者组蛋白H3都是被经常使用的,而针对一些研究线粒体的客户,那么Cox IV则被较多的文献引用作为线粒体总蛋白的内部参考。下面就常用的一些内参抗体做一些介绍。

1.GAPDH抗体

GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶,由4个30-40kDa的亚基组成,分子量146kDa,检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达,被广泛地用作Western blot蛋白质标准化的内参。

 

2. β-Tubulin抗体

Tubulin即微管蛋白,是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin,其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体,是形成微管的zui主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分别为55kDa和50kDa,其实际检测条带均在55kDa左右。作为内参,β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变,因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照,α-Tubulin和β-Tubulin构成微管蛋白的结构也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

 

3. Beta-Actin内参抗体

Actin即肌动蛋白,是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,其余两种广泛分布于各种组织中,包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的,这是针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞浆内,表达量非常丰富,其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下,如脂肪组织或细胞β-Actin抗体推荐—价的内参抗体内,β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成,分子量大小为42-43kDa左右。

 

那么如何选择合适的内参抗体呢?内参抗体虽然选择较多,但是也需要遵循一定的原则,并契合实际的应用需要。推荐的内参要与检测的目的蛋白的分子量zui好相差5KD以上,因此需要根据目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参,例如:GAPDH的检测分子量大约在36kD,因此该内参抗体不是很适合用于检测30kD-40kD大小目标蛋白的WB实验中;β-Actin的检测分子量大约在42kD,因此该内参抗体不是很适合用于检测38kD-48kD大小目标蛋白的WB实验中。另外,不同的组织来源的样本在选择内参时还有一定的区别。比如某些细胞中,由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高,不适合做内参。另外,虽然β-Actin是zui合适的内参抗体之一,但是在某些条件下,一些因素也会导致样品间β-Actin含量的变化,例如在脂肪组织里,β-Actin的表达量非常低,就不适合作为内参。

 

就一般的蛋白检测来说,β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了,而针对于核蛋白的定量,特别是样本蛋白就是核蛋白时,选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3,除此之外,其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等,在一些文献报道中,Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测,常用的内参抗体为Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测,常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

以上几条原则只是针对通常情况,但是需要注意的问题是——内参的选择需要考虑实际的试验环境并查询相应文献,在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常,应综合考虑这方面因素。

 

爱必信部分内参抗体订购信息如下,更多内参抗体信息详情见。

货号

产品名称

反应种属

应用

来源种属

规格

abs830030

Anti-GAPDH Antibody

Human, mouse, African green monkey

WB,IP

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs118936        

GAPDH Polyclonal Antibody

Human Mouse Rat

WB, IHC, IF

Rabbit

50ul/100ul/500ul

abs130609

GAPDH Antibody

H, Mk

WB

Rabbit

50ul/100ul/500ul

abs132004

GAPDH antibody

Human, Mouse, Rat

WB,IHC, IF

Rabbit

50ul/100ul/500ul

abs137959

GAPDH Mouse Monoclonal Antibody

H, R, M, Mk, Dg, Ch, Hm, Rabbit,Pg

WB, IHC, IF

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs124037

Rabbit Anti-GAPDH Polyclonal Antibody

Human, Mouse, Rat, Rabbit,

WB,IHC-P,IHC-F,IF

Rabbit

50ul/100ul/500ul

abs139055

GAPDHS Antibody

Human

WB

Rabbit

50ul/100ul/500ul

abs100531

GAPDH Antibody, HRP Conjugate

Human

WB

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs830031

Anti-beta actin Antibody

human. mouse, African green monkey

WB、IP

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs132001

Beta actin antibody

Zebrafish,Dog,Monkey,Human,Mouse,Rat,Pig

WB,IHC,IF

Rabbit

50ul/100ul/500ul

abs119600

Rabbit Anti-beta Actin Polyclonal Antibody

Human, Mouse, Rat, Chicken, Dog, Pig, Cow, Rabbit, Sheep , Bee, Fish, Guinea Pig, Hamster, Goat, Cat, mt,op

WB,ELISA,IHC-P,IHC-F,Flow-Cyt,IF

Rabbit

50ul/100ul/500ul

abs137975

beta-Actin Mouse Monoclonal Antibody

Human; Monkey; Mouse; Rat; hamster; Dog; Spodoptera frugiperda; chicken,rabbit.Pg

WB, IHC, IF/ICC

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs112431

Beta-Actin Antibody

H, R

WB

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs830032

Anti-β-tubulin Antibody

human. mouse, African green monkey

WB,IP

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs119784

Rabbit Anti-Tubulin-beta Polyclonal Antibody

Human, Mouse, Rat, Pig, Cow

ELISA,IHC-P,IHC-F,Flow-Cyt,IF

Rabbit

50ul/100ul/500ul

abs131994

Tubulin beta Antibody

Human, Mouse, Rat

WB, IHC

Rabbit

50ul/100ul/500ul

abs137981

Tubulin beta Antibody

Zebrafish

WB

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs112431

Beta-Actin Antibody

H, R

WB

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs132184

beta-Actin antibody

Human,Mouse,Hamster,Rat,Monkey

ELISA, WB, ICC, FCM

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs137975

beta-Actin Mouse Monoclonal Antibody

Human; Monkey; Mouse; Rat; hamster; Dog; Spodoptera frugiperda; chicken,rabbit.Pg

WB, IHC, IF/ICC

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs100041

Beta-Actin Antibody

H, M, R

IHC-P, IF, WB

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs100006

Beta-actin Antibody

H, M, R

WB, IHC-P

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs100462

Histone H3 Antibody

H, R, M

WB

Mouse

50ul/100ul/500ul

abs112443

Histone H3 Antibody

H, R

WB

Mouse

50ul/100ul/500ul

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