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点击次数:2236 发布时间:2018-04-24

实验室WB常见问题指南之Marker,染色及内参等相关问题

Marker,染色及内参等相关问题

Q:用的是预染marker,但是电泳总跑不全8条带,请问什么原因?怎样改善?胶用过8%,10%,12%,都是这样。marker是新买的。

A:一般来说,是小分子量Marker跑走了,可以增加胶浓度或减少电泳时间。梯度胶也是不错的选择。(梯度凝胶爱必信就可提供呦)

Q:Western Blot哪种染色好?

A:(1)阴离子染料是zui常用的,特别是氨基黑,脱色快,背景低检测极限可达到1.5μg,考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度,但脱色慢,背景高。丽春红S 和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ,以便进行随后的氨基酸分析。缺点是:溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用于正电荷的膜。灵敏度低。

   (2)胶体金,灵敏度高,检测范围可到pg级,但染色比稳定。

   (3)生物素化灵敏度位于1、2之间,可用于任何一种膜。

Q:是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参?

A:对于发表文章的实验一定要加内参,实验严谨。

Q用BANDSCAN分析结果行吗?

A:分析一般的结果没问题。

Q: 核内抗原Western Blot内参选择什么合适?

A:可以选用组蛋白,组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的,有很多都可以当成内参,在网上查查就可以选出你要的内参。

Q转膜时采用电流是否比电压准确,是否根据0.8mA/cm2,一般1小时左右?

A:不是的, 半干法推荐用恒流,一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间,一般蛋白越大,转膜所需时间就越长。

Q:封闭,一抗,二抗时的温度有没有什么规定呢,比如现在我就在室温里做,或者要在4度下?

A:均可在室温进行,如果时间不够,一抗孵育可以先在室温进行一个小时,然后4度过夜。

Q: PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么?

A:一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,这样的话,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合 (注:常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜),同时也有疏水作用,但相对较弱。这样的话,PVDF膜和蛋白接合较牢,不易脱落,结果较好。

Q:酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等?

A:NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂,一般建议添加。


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